CUGA®シークエンシングシステムは、RNAポリメラーゼによる転写反応を応用していますので、鋳型DNAには、必ずプロモーター配列を導入する必要があります。鋳型DNAのプロモーター配列導入法として、以下の方法があります。




 PCRによる鋳型DNA調製法は、PCR産物の精製操作を全く必要とせず、PCR反応溶液を一部シークエンス反応液に添加するだけでシークエンス反応ができるので、鋳型DNA調製からシークエンス反応までの操作が大幅に短縮できます。
 PCR産物を転写シークエンス反応用の鋳型として使用するには、ターゲットDNAを増幅する一方のプライマーの5'末端側に(図1)に記載されているプロモーター配列を付加する必要があります。
 また、ターゲットDNAを増幅する各プライマーの5'末端側にそれぞれ(図1)で示したT3プロモーター、T7プロモーターを付加したものを用いてPCRをおこなうと、ターゲットDNAの両側にT3、T7各プロモーターが付加した構造の鋳型DNAができます。これにより、CUGA®3RNAポリメラーゼ、CUGA®7RNAポリメラーゼによる両鎖からのシークエンシングが可能です。




(1)プラスミドDNAの種類
 CUGA®シークエンシングシステムは、T3およびT7RNAポリメラーゼによる転写反応を利用していますので、シークエンス反応をおこなう際は、必ずT3およびT7プロモーター配列を有するプラスミドDNAを使用してください

 弊社では、CUGA®シークエンシングシステム用に開発したクローニングベクター"pTS1"もご用意しております。CUGA®シークエンシングキットと併用することで、非常に優れた解析結果を得ることができます。しかも本クローニングベクターは、従来のサイクルシークエンス法にも使用できますので、あらかじめ本クローニングベクターをご利用になると便利です。

(2)プラスミドDNAの調製方法
 プラスミドDNAの調製方法は幾つかありますが、一般的におこなわれている調製方法、又は市販のキットを用いた調製方法で結構です。ただし、RNase処理は必ずおこなうようにしてください。RNase処理をおこなった場合は、フェノール処理を必ずおこない、RNaseを完全に失活させてください。
 また、この場合も先ほどの「PCRによる方法」と同様、CUGA®3RNAポリメラーゼ、CUGA®7RNAポリメラーゼによる両鎖からのシークエンシングが可能です。





CUGA®は、株式会社ニッポンジーンテクの日本における登録商標です。


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